細菌纖維素酶研究進展

2019-05-08

摘要:概述了細菌纖維素酶(Enzyme)的水解機制及其基因的克隆和表達,總結了近年來纖維素酶結構和功能方面的研究成果,展望細菌纖維素酶領域的研究前景。
關鍵(解釋:比喻事物的重要組成部分)詞:細菌;纖維素酶;基因克隆;結構(Structure)與功能
作者簡介:陳春嵐(1971-),女,廣西昭平人,廣西賀州學院講師,廣西大學碩士研究生,主要從事微生物學細菌纖維(Fiber)素研究。
1 引言
目前,纖維素是最豐富的可再生有機資源,其生物降解主要由微生物——細菌和真菌完成。細菌主要產中性纖維素酶和堿性纖維素酶,這類酶制劑對天然纖維素的水解作用較弱,長期以來沒有得到足夠的重視。但原核生物的基因一般不含內含子,可直接從基因組DNA中克隆到目的基因用于工程菌的構建。因此細菌纖維素酶基因的克隆,既利于研究纖維素酶基因的多樣性,也利于高效纖維素酶基因工程菌的構建。隨著中性纖維素酶和堿性纖維素酶在棉織品水洗整理工藝及洗滌劑工業中的成功應用,以及耐熱性纖維素酶在燃料酒精生產中應用,細菌纖維素酶制劑已顯示出良好的應用性能和巨大的經濟價值。
2 纖維素分解性細菌的類群
纖維素分解性細菌是指能分解纖維素的細菌,分三大類群:(1)厭氧發酵型:芽孢梭菌屬(Clostridium)、牛黃瘤胃球菌屬(Ruminococcus)、白色瘤胃球菌(Ruminococcusalbus)、產琥珀酸擬桿菌(Bacteroides succinogenes)、產琥珀酸絲狀桿菌(Fibrobactersuccinogenes)、溶纖維菌(Butyrivibrio fibrisolvens)、熱纖梭菌(Clostridium thermocellum)、解纖維梭菌(Clostridiumcellulolyticum);(2)好氧型:糞堿纖維單胞菌(Cellulomonasfimi)、纖維單胞菌屬(Cellulomonas)、纖維弧菌屬(Cellvibrio)、發酵單胞菌(Zymomonas)、混合纖維弧菌(Cellvibrimixtus);(3)好氧滑動菌,如噬胞菌屬(Cytophaga)。上海生物發酵展淀粉在餐飲業中又稱芡粉,水解到二糖階段為麥芽糖,完全水解后得到單糖。
3 細菌纖維素酶基因的克隆與表達
細菌中編碼纖維素酶的基因在基因組的分布為隨機的或形成基因簇。在基因簇中,有轉錄終止子,沒發現有啟動子。人們已從40多種細菌中克隆到了纖維素酶基因,其中一些酶基因已經在大腸桿菌和酵母中得到表達。如從Stropyomyce
  S、Clostridiu
  M、Thermoanaer obacte
  R、Themomonspor
  A、Erwini
  A、Pseudomona
  S、Cellvibri
  O、Ruminococcu
  S、Cellulomona
  S、Fibrobacter 和 Bacillus 中成功分離出葡聚糖基因,并先后克隆了瘤胃的Bacteroide
  S、succi nogenes 、Butyrivibrio sp Ruminococcus albus等細菌的纖維素酶基因,同時熱梭菌中的11種內切纖維素酶(Cel
  A、Cel
  B、Cel
  D、Cel
  E、Cel
  F、Cel
  G、Cel
  H、Cel
  I、Cel
  J、Cel
  K、CelS)的基因已經被克隆,嗜纖維梭菌的5種內切纖維素酶(Eng
  A、Eng
  B、Eng
  C、Eng
  D、EngE)已經測序并在大腸桿菌中得到表達。楊智源、劉永生、游銀偉等從不同的細菌中克隆了內切葡聚糖酶基因[1-3]。Kim等克隆了Aquifex aeolicus VF5編碼EG的 ce18Y基因,在E.coli XL1 -Blue中成功表達,Hakamada等運用盒式連接介導PCR 和反向PCR 克隆到了基因egl-257。人們將纖維素酶、纖維二糖等外源基因轉入運動發酵單胞菌(Zymomonas mobilis)中并得到不同程度的表達,有望將它改造為能將纖維素轉化為乙醇的重組菌株并在工業中廣泛應用。細菌葡聚糖酶基因在S.cerevisiae的啟動子和信號肽的控制下構建在同一質粒載體上,然后轉入S.cerevisiae, 重組菌可向培養基分泌保留70%活性的葡聚糖內切酶和外切酶,這種酶能夠分解濾紙和木漿中的纖維素。
4 細菌纖維素酶分類
細菌纖維素酶(Enzyme)是多酶復合體系,根據各酶的功能可分為三大類:(1)內切葡聚糖酶(1,4-D-glueanohydrolase或endo-1,4-β-D-glucanase,EC 3.2.1.4),簡稱Cen。作用于纖維素內部的非結晶區,隨機水解β-1,4-糖苷鍵,將長鏈纖維素分子截短,產生大量非還原性末端的小分子纖維素,其分子量大小約為23-146KD。(2)外切葡聚糖纖維二糖水解酶(1,4-β-D-glucan cellobio-hydrolase或exo-1,4-β-D- glucanase,EC
  3. 2.1.91),簡稱Cex。作用于纖維素線狀分子末端,水解β-1,4-D-14糖苷鍵,依次切下一個纖維二糖分子,故又稱為纖維二糖水解酶(cellobiohydrolase),分子量約38-118 KD。(3)β-葡萄糖苷酶(β-1,4-glucosidase, EC3.2.1.21)簡稱BG或稱纖維二糖酶。這類酶一般將纖維二糖或可溶性的纖維糊精水解成葡萄糖分子,其分子量約為76KD。
5 細菌纖維素酶水解(Hydrolysis)機制
好氧細菌的三種纖維素酶是以各自獨立的形式分泌到細胞外水解纖維素的;厭氧細菌的三種纖維素酶以多酶復合體形式結合在細胞壁上對纖維素進行水解。細菌纖維素酶通過多酶復合體系各組分協同作用徹底有效降解天然纖維素。Cen負責進攻纖維素的非結晶區,隨機水解β- 1,4 - 糖苷鍵,將長鍵纖維素分子截短,產生大量帶非還原性末端的小分子纖維素,Cex負責從纖維素線狀分子的非還原性末端水解切下纖維二糖單位,BG則將纖維二糖水解成葡萄糖,但對于Cen和Cex 的作用順序尚未定論。
在已知結構的細菌纖維素酶分子中,通過在異頭碳原子位通過構型的保留或構型的轉化完成催化反應,其中兩個保守的羧基氨基酸(Acerbity)分別作為質子供體和親核試劑,如C . thernmocellum的內切酶CelC催化域中Glu-280和Glu-140分別作親核試劑和質子供體, C .fimi的外切酶Cex的Glu-574和Glu-645分別作親核試劑和質子供體,證明了細菌纖維素酶降解纖維素的水解(Hydrolysis)雙置換機制。由于纖維素底物的高度復雜性以及底物的多樣性,纖維素水解過程的并沒有完全清楚。因此,纖維素酶系的降解機理還有待進一步研究和探討。
6 細菌纖維素酶的結構和功能
通過對糞堿纖維單胞菌(Cellulomonas fimi)的一個外切酶Cex和一個內切酶CenA的研究表明,細菌纖維素酶的纖維素結合結構域(CBD)位于氨基端或羧基端,它借助連接橋(Linker)與催化結構域(CD)連接。在多種細菌的纖維素酶中發現有相似的結構[8]。
6.1 催化結構域(CD)
纖維素酶分子的催化結構域主要體現酶的催化活性及對特定水溶性底物的特異性。不同來源纖維素酶分子量差別很大,但其催化區的大小卻基本一致,活性位點的三級結構都是保守區域。Juy M et 等采用x光衍射的方法對熱纖梭菌(fungus)的Cel D的催化域進行了結晶和解析[4]。結果表明,內切酶的活性位點位于一個開放的 ;裂縫 ;(Cleft)中,可與纖維素鏈的任何部位結合并切斷纖維素鏈;外切酶的活性位點位于一個長 ;環 ;(1oop)所形成的 ;內部通道 ;(tunnel)里,它只能從纖維素鏈的非還原性末端切下纖維二糖。細菌的外切酶有兩個酶切位點,有限酶切時,可將CBD和連接橋分別切去。Meinke A 等利用蛋白質(protein)工程的方法將糞堿纖維單胞菌的外切酶Cbh A分子的Loop刪除后,發現該酶的內切酶活性提高[5]。根據其氨基酸序列的相似性已知的纖維素酶的CD可分為70多個家族,在同一家族內具有相似的分子折疊模式和保守的活性位點,因此在同一家族內,其反應(reaction)機制和對底物的特異性都可能相同,這已通過實驗得到證實。
6.2 纖維素結合結構域(CBD)
許多纖維素酶主要依靠在肽鏈N端或C端的CBD結合底物,該結構又稱纖維素結合模塊,其功能是將相鄰的催化結構域傳遞到晶體纖維素底物上。中國最大生物發酵展淀粉是植物體中貯存的養分,貯存在種子和塊莖中,各類植物中的淀粉含量都較高。上海發酵展糊化作用的過程可分為三個階段:(1)可逆吸水階段,水分進入淀粉粒的非晶質部分,體積略有膨脹,此時冷卻干燥,顆粒可以復原,雙折射現象不變;(2)不可逆吸水階段,隨著溫度升高,水分進入淀粉微晶間隙,不可逆地大量吸水,雙折射現象逐漸模糊以至消失,亦稱結晶“溶解”, 淀粉粒脹至原始體積的50~100倍;(3)淀粉粒最后解體,淀粉分子全部進入溶液。細菌纖維素酶的CBD由100-110個氨基酸(Acerbity)組成,同源性較低。細菌CBD平坦的表面只露出2個或3個芳香族氨基酸殘基和一些形成氫(Hydrogen)鍵的殘基,多項研究證實,這些殘基與CBD對結晶纖維素的結合有關。一些細菌的CBD結構有一定的共同特點:帶電荷氨基酸含量很低;羥基氨基酸含量很高;都含有Tr
  P、Asn和Gly,而且兩個Cys在
  N、C末端的位置完全相同。汪天虹等用多維核磁共振和X射線衍射技術,證實了族Ⅱ C. Fimi Ce
  X、Cen以及族Ⅲ C.thermocelhun Cip的CBD有相似的結構:由2個β片層面對面折疊在一起,形成一個β三明治結構,CBDcex含有一個單一的二硫橋連接N-末端和C-末端,CBDcip有一個Ca2+的高親和性結合位點[6]。然而,有的CBD的作用似乎不在于跟底物結合,而是破壞晶體纖維素鏈間的非共價相互作用;或者不僅結合底物,還提供結合不同底物結構的優先權。楊永彬等通過實驗證實家族Ⅱ的CBD能夠促使纖維素中氫鍵的斷裂,從而釋放單根纖維素分子鏈[7]。C.fimi的 CenA或Cex單獨的CBD不具備對纖維素的水解活力,但能破壞棉纖維,形成短纖維,具有疏解結晶纖維素的能力。實驗證明,特殊結構:莢膜、鞭毛、菌毛纖維素酶中的CBD對酶的催化活力是非必需的,但它們具有調節酶對可溶性和非可溶性底物專一性活力的作用。
6.3 連接橋(1inker)
連接肽(1inker)一級結構的研究(research)發現,細菌纖維素酶分子的連接肽富含脯氨酸(Pro)和絲氨酸(Thr),完全由Pro-Thr這樣的重復序列約100多個氨基酸殘基組成。在高級結構的分子形狀上,細菌連接肽、C
  D、CBD之間呈135o。連接肽的作用(role)可能是保持CD和CBD之間的距離,有助于不同酶(Enzyme)分子間形成較為穩定的聚集體。
6.4 特殊結構:莢膜、鞭毛、菌毛纖維素酶關鍵氨基酸殘基
運用定點誘變技術,以合成的寡核苷酸作誘變物,在已知的核苷酸序列中準確地誘變密碼子中的一個或數個堿基,改變組成蛋白質的一個或數個氨基酸殘基,以確定功能性氨基酸基團,目前對糖基水解酶中第5、6、7、9、45族的催化機制和功能性氨基酸的研究成果較多。
Bacillus sp.的纖維素酶是糖基水解酶族5 中研究較早的纖維素內切酶,結構上具有(α/β)8折疊桶結構, 通過底物異頭碳原子位的構型保留進行催化反應,研究發現這些高度同源的纖維素酶的酶反應最適pH有較大的差異[8]。如B .subtili 的BSC為中性纖維素酶, Bacillus sp. N4的NK1為堿性纖維素酶。在堿性環境下用Asn 和Ser 分別代替NK1 region 5中的Ser287 和Ala296,結果使得NK1 的酶反應pH范圍與BSC的幾乎一致,這表明Ser287 和Ala296 對NK1在堿性環境的活性起著重要的作用。但在酸性范圍內, NK1 region5中的各種氨基酸取代都不影響其酶反應pH 范圍。根據這一發現,推斷Ser287和Ala296為影響酶反應pH 范圍的功能性氨基酸殘基,并且認為Ser287和Ala296的替代造成了底物吸附位點或催化位點的氫鍵網重組。
C. fimi 纖維素酶Cel6A屬于糖基水解酶族6,結構上具有七股平行鏈組成的β-折疊桶中心結構,通過底物異頭碳原子位構型轉化進行催化反應。對C. fimi Cel6A 的四個保守Asp 殘基Asp216,Asp252,Asp287, Asp392 的突變研究表明,Asp252 和Asp392分別作為其酸催化劑和堿催化劑,Asp287 對Asp252 起輔助催化作用,Asp216對催化幾乎不影響。Wolfgang DE等對照C.fimi Cel6A 研究了T .fusca Cel6A 的Asp 79 Asp117,Asp 156和Asp265。結果發現Asp79 對應于C .fimi Cel6A 的Asp 216 卻有很大不同,它不但能提高Asp 117 的pKa,而且對于催化活性也很重要,而且研究還發現,Asp265Asn 突變株仍然保留野生型酶7 %的活性。這表明Asp265 并不起堿催化劑的作用,這與高度同源的C.fimi Cel6A的實驗結果顯然不同。
Clostridium . stercorarium CelZ 屬于族9纖維(Fiber)素酶。Riedel 等推斷其催化殘基為Asp84 和Glu447,位于蛋白的N - 末端,取代CelZ 的一個或兩個催化殘基,結果完全消除了其對微晶纖維素的攻擊能力,但在水解CMC時, 卻檢測到了Asp84 替代物的內切酶活性,這可能是發生在CMC 上的羧化作用而引起的 ;催化拯救 ;作用造成的,這與族6 纖維素酶的研究情況非常相似。
H .insolens Cel45A是族45纖維素酶的代表, , 通過底物異頭碳原子位構型的轉化進行催化反應,具有很強的除垢功能。對其底物吸附溝的殘基Tyr147 進行了研究,誘變動力學分析表明,這一區域的芳香族氨基酸對吸附有很重要的作用。研究發現其結構由一個帶有互相連接長環的六鏈桶組成,而且在酶的表面有一個40Å 的溝,包含催化殘基Asp10 (可能為堿催化劑) 和酸催化劑Asp121。
7 展望
細菌以多酶復合體結構徹底有效降解天然纖維素,纖維小體是研究較多的細菌纖維素酶復合體。纖維小體的作用方式是理解纖維素降解和利用纖維素資源的關鍵。進一步了解纖維小體結構的普遍性,不同來源的纖維小體的組成同源性和多樣性,纖維小體蛋白質之間的相互作用,纖維小體組織結構的形態發生等,從而為工程改造纖維小體,利用纖維素資源提供基礎。
提高纖維素酶的分離純化技術,利用基因工程和蛋白質工程的手段,對它的空間結構作進一步的研究,以便更好地了解它的結構、酶學特性和協同作用的降解機制,為纖維素酶蛋白質分子的改造和設計提供理論基礎。
通過構建培養和未培養細菌的基因組DNA文庫,篩選到高效的、多樣性的纖維素酶基因,利用體外DNA分子定向進化等基因操作技術,構建適應不同需要的高效工程菌,比如把纖維素酶基因克隆到Z.molis或釀酒酵母中,可以直接利用纖維素轉化生產酒精。
 
參考文獻
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